熒光顯微鏡常用的激發(fā)光源

綠色熒光蛋白（green fluorescent protein，GFP）在收到紫光外或者藍(lán)光激發(fā)時(shí)，發(fā)射綠色熒光，可在各種異源細(xì)胞，如細(xì)菌/昆蟲以及植物細(xì)胞中表達(dá)，在植物研究中，通常需要各種顯微鏡來確定該基因是否表達(dá)，偶爾也會(huì)因?yàn)橹参镒园l(fā)熒光導(dǎo)致假陽性的誤判。熒光顯微鏡常用的激發(fā)光源甚至肉眼就可以觀察到，且靈敏度高，對(duì)于單細(xì)胞水平的表達(dá)也可識(shí)別。

綠色熒光蛋白在紫外線的激發(fā)下發(fā)光

GFP是從水母分離出的一種天然熒光蛋白，分子量約27000。為一個(gè)由238個(gè)氨基酸殘基組成的單鏈多肽，其熒光發(fā)射峰在509nm，zui大激發(fā)波長(zhǎng)為395 nm，并在470 nm處有一肩峰，GFP的化學(xué)性質(zhì)相當(dāng)穩(wěn)定，其變性需在90℃或pH<4．0或ph>12．0的條件下用6mol／L鹽酸胍處理。GFP的熒光發(fā)光有兩個(gè)明顯的吸收帶，對(duì)應(yīng)于GFP的兩種不同構(gòu)象的基態(tài)A和B。基態(tài)A對(duì)應(yīng)于395nm的吸收峰，基態(tài)B對(duì)應(yīng)于475nm的吸收峰，基態(tài)A占優(yōu)勢(shì)，基態(tài)B的分子數(shù)量約是基態(tài)A的1／6，兩種基態(tài)間能緩慢地轉(zhuǎn)換，但激發(fā)態(tài)A 之間的轉(zhuǎn)換很快且發(fā)生了質(zhì)子轉(zhuǎn)移，A 快速高效地衰變至另一激發(fā)態(tài)，應(yīng)該存在一個(gè)中間過度態(tài)I，質(zhì)子轉(zhuǎn)移使A 轉(zhuǎn)變成I ，I 回遷到基態(tài)I時(shí)產(chǎn)生發(fā)射峰504nm的熒光，構(gòu)象改變使I 轉(zhuǎn)變成B ，由B到B發(fā)射熒光而不發(fā)生質(zhì)子轉(zhuǎn)移。目前，對(duì)于GFP的作用機(jī)理較為認(rèn)同的僅僅是：GFP是生物發(fā)光過程中的能量受體，并且是zui終的發(fā)光體，不同的生物發(fā)光機(jī)制各不相同，不同的突變體發(fā)光機(jī)制也有很大差異。

圖一：綠色熒光蛋白在LUYOR-3415RG激發(fā)光源的激發(fā)下發(fā)光

除此之外，LUYOR-3415實(shí)驗(yàn)室燈還可以用做以下用途：

1、 野外、實(shí)驗(yàn)室原位測(cè)定RFP(紅色熒光蛋白)。

2、 應(yīng)用于轉(zhuǎn)基因作物研究。

3、 區(qū)別可遺傳性改良生物體和不可遺傳的改良生物體。

4、 用于基因表達(dá)的研究。

5、 用于Rhodamine（紅色熒光染料）、葉綠素、熒光素的研究。

為什么藍(lán)光和紫外線激發(fā)光源能激發(fā)GFP發(fā)出綠色熒光？

綠光蛋白GFP吸收的光譜峰值為395nm（紫外），并有一個(gè)峰值為470nm的副吸收峰（藍(lán)光）；雖然450～490nm只是GFP的副吸收峰，但由于長(zhǎng)波能量低，細(xì)胞忍受能力強(qiáng)，更適合活體檢測(cè)，因此通常多使用藍(lán)光波段光源（多為488nm）。GFP發(fā)射光譜zui大峰值為509nm（綠光），并帶有峰值為540nm的側(cè)峰（Shouder）。

圖二：LUYOR-3280UV紫外激發(fā)光源

為什么藍(lán)光和紫外線激發(fā)光源能激發(fā)GFP發(fā)出綠色熒光？

熒光蛋白GFP發(fā)光原理

熒光蛋白發(fā)光類型屬于斯托克斯位移型，其基本原理是生色團(tuán)在較高能量的光子照射下發(fā)生構(gòu)象的改變，從而導(dǎo)致分子能級(jí)變化，從高能級(jí)的構(gòu)象躍遷向低能級(jí)時(shí)發(fā)出較低能量的光子。生色團(tuán)在發(fā)光過程中主要有兩種化學(xué)過程。一是質(zhì)子轉(zhuǎn)移，即質(zhì)子化和去質(zhì)子化，二是分子構(gòu)象的改變。生色團(tuán)主要有三種構(gòu)象：A型、B型以 及中間過渡態(tài)Z 型。在分子構(gòu)象變化的同 時(shí)還伴隨著氫鍵的生成和斷裂，以及電荷的傳遞去質(zhì)子化和質(zhì)子化的分子構(gòu)象不同， 對(duì)應(yīng)的分子能級(jí)也不同，從而其發(fā)射光譜中有兩個(gè)特征峰，代表兩種躍遷過程。質(zhì)子化構(gòu)象生色基團(tuán)通過Tyr66 的脫質(zhì)子狀和質(zhì)子化狀態(tài)(酚羥基)的轉(zhuǎn)換決定熒光發(fā)射。由于酚的激發(fā)態(tài)酸性遠(yuǎn)大于其基態(tài), 故僅脫質(zhì)子態(tài)的結(jié)構(gòu)發(fā)射熒光。這個(gè)過程是十分迅速的，因此熒光蛋白發(fā)射的是熒光而不是磷光，需要激發(fā)光源持續(xù)存在才可連續(xù)發(fā)光。但是其極快的激發(fā)響應(yīng)使得熒光蛋白適合作為高靈敏度生物探針以及生物成像材料。

圖三：LUYOR-3415RG激發(fā)光源照射煙草葉片的GFP發(fā)光

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