中國農業(yè)科學院蔬菜花卉研究所近日在《Horticulture Research》發(fā)表了文獻為《Targeted creation of new mtants with compact plant architecture using CRISPR/Cas9 genome editing by an optimized genetic transformation procedure in cucurbit plants》。本文獻中采用了LUYOR-3415RG熒光蛋白激發(fā)光源來篩選GFP陽性的植株。
文獻摘要
葫蘆科的水果和蔬菜，如黃瓜、甜瓜、西瓜和南瓜，對人類飲食有很大貢獻。基因組編輯技術的廣泛使用極大地加速了基因功能表征和作物改良。然而，大多數經濟上重要的葫蘆科植物，包括甜瓜和南瓜，仍然對標準的根癌農桿菌介導的轉化具有抗拒性，從而限制了基因組編輯技術的有效使用。在本研究中，我們采用“佳滲透強度"策略建立了的甜瓜和南瓜遺傳轉化系統。我們利用這種方法的力量來靶向ERECTA的同源物受體激酶基因家族，并創(chuàng)造了等位基因，導致甜瓜、南瓜和黃瓜中節(jié)間較短的緊湊植物結構。此處介紹的優(yōu)化轉化方法能夠實現穩(wěn)定的 CRISPR/Cas9 介導的誘變，并為葫蘆科作物的功能基因操作提供了堅實的基礎。
葫蘆科長期以來被認為是難轉化的作物之一，嚴重阻礙了基因組編輯工具的應用。在黃瓜和西瓜中已經報道了成功的遺傳轉化和基因組編輯[ 13 , 14 ]。然而，黃瓜的轉化效率仍然很低，用于西瓜再生的間接器官發(fā)生目前與其他葫蘆科作物不兼容。因此，其他經濟上重要的葫蘆科作物，如甜瓜和南瓜，仍然難以穩(wěn)定轉化，這極大地阻礙了功能基因組研究和快速產生賦予這些作物理想性狀的突變。
農桿菌浸潤被認為是建立穩(wěn)定的遺傳轉化系統的關鍵。在器官發(fā)生過程中，不定芽從不同植物物種的原形成層或形成層細胞開始 [ 25 ]，這些組成了農桿菌感染的靶組織。然而，盡管以前的研究認識到需要感染外植體的更深細胞層，但尚未開發(fā)出統一的標準協議來實現這一目標。在實踐中，必須在感受態(tài)細胞的充分感染和整個外植體的過度感染之間取得良好的平衡，這會導致嚴重的損傷并降低轉化效率。
為了克服這些問題，我們采用了佳強度的浸潤策略來確定特定的一組條件，以確保血管組織中的形成層細胞*感染，同時對外植體造成盡可能小的損傷。在這里，我們確定了真空滲透、超聲處理和微刷的佳強度，以獲得良好的甜瓜和南瓜轉化效率，我們還在培養(yǎng)基中添加了抗氧化劑 LA，以保護外植體免受損傷。在這些優(yōu)化的條件下，維管組織感染有效，外植體損傷小，導致甜瓜和南瓜的穩(wěn)定遺傳轉化，效率約為4%。使用相同的策略，我們提高了不同黃瓜種質的轉化效率，并部分克服了基因型依賴性。
這種在葫蘆科作物中且穩(wěn)定的遺傳轉化系統使我們能夠在這些物種中進行 CRISPR/Cas9 介導的基因組編輯。擬南芥ER基因家族編碼富含亮氨酸的重復受體樣激酶，已被證明可調節(jié)莖伸長 [ 27 ]。編輯瓜類ER同源物在甜瓜、南瓜和黃瓜中產生了er突變體。所有突變體都具有較短的節(jié)間和矮化表型，這可能有利于改善植物結構和育種。
總之，我們提出了一種穩(wěn)定的甜瓜和南瓜遺傳轉化系統，并證明 CRISPR/Cas9 介導的基因組編輯在這些葫蘆科作物中是有效的。這里描述的方法將大大加快對葫蘆科作物的研究，包括基礎植物生物學和優(yōu)良品系的創(chuàng)造。
植物材料和生長條件
本研究分析了十個甜瓜品種：P147（栽培甜瓜）、ivf105（栽培甜瓜） 、m1（栽培甜瓜）、m2（栽培甜瓜）、m3（栽培甜瓜）、m4（栽培甜瓜）、m5（野生甜瓜） , m6 (栽培甜瓜), m7 (栽培葡萄) 和景玉（商業(yè)雜交種），其中 ivf105 和 m1 到 m7 由中國農業(yè)科學院蔬菜花卉研究所（IVF）王懷松提供。本研究使用黃瓜自交系Cu2（華南型）、新太米刺（華北型）、404（華北型）和Eu1（歐洲型）的種子。兩種商業(yè)moschata材料，金心針4號和金心針11號，用于南瓜改造。在分化和生根階段將所有組織培養(yǎng)物保持在培養(yǎng)室中。生根后，將再生植物轉移到培養(yǎng)箱中約一周，然后在溫室中種植，光照條件為 16 小時光照/8 小時黑暗，溫度范圍為 18°C 至 24°C。
需要使種子發(fā)芽以獲得外植體，種子發(fā)芽的條件如下。將種子在 50°C 的溫蒸餾水中浸泡 30 分鐘，然后用鑷子去除種皮。種子用 75% 乙醇 15 秒和 1% 次氯酸鈉溶液 15 分鐘進行表面消毒，然后用無菌蒸餾水沖洗 6 次。瓜子、南瓜和黃瓜的滅菌種子在 28°C 下在含有 7.5 mL 滅菌水的培養(yǎng)皿上涂抹 1-2 天。在 28°C 下，僅將 Cu2 種子散布在含有 GM 培養(yǎng)基的培養(yǎng)皿上。
sgRNA設計和質粒構建
sgRNA 是使用 CRISPR-GE 網絡工具 設計的。如前所述 [ 49 ] 將 sgRNA 插入 pBSE402 載體。簡而言之，將含有 1.5 μL 100 μM 正向引物、1.5 μL 100 μM 反向引物、5 μL 10× NEB 緩沖液 3.1 和 42 μL 水的 50 μL 混合物在 95°C 下孵育 5 分鐘，然后升溫以 0.1°C/s 下降到 20°C，產生一個短的雙鏈 DNA 片段。使用限制酶Bsa I 和 T4 連接酶 (New England Biolabs)將短 DNA 片段插入 pBSE402 。將構建的重組載體轉化農桿菌菌株EHA105。引物顯示在表 S2。
檢測 GFP 熒光
為了篩選 GFP 陽性植物，在組織培養(yǎng)階段使用 Leica MZ10 F 立體顯微鏡（Leica Microsystems，Germany）檢查再生一個月的外植體。在溫室中用LUYOR-3415RG激發(fā)光源（Luyor Instrument，上海）激發(fā)后觀察植物的綠色熒光蛋白GFP熒光。將不同感染強度處理的外植體在冰上沿橫向和縱向手工切片，在立體顯微鏡下立即觀察到有血管組織部分的GFP熒光。
上圖為：（a，b和c）GFP強度，感染維管組織的外植體，以及五種不同處理下甜瓜m1的存活率，分別。數據是三個重復的平均值，誤差線表示標準偏差。不同的小寫字母表示差異顯著（p<0.05，Tukey 檢驗）。(d) 將再生的轉基因 T0 甜瓜植物轉移到土壤中。轉基因甜瓜 T0 植物的 GFP 熒光頂端分生組織 (e) 和種子 (f 和 g)。LUYOR-3415RG 的 GFP 通道下甜瓜的轉基因 T1 植物 (h) 和 WT (i)。組織因 GFP 表達而呈綠色，因葉綠素自發(fā)熒光而呈紅色。
注：內容為谷歌翻譯，并非原作者翻譯
